Los avances en nuestra comprensión de la biología celular están íntimamente relacionados con los nuevos microscopios ópticos y técnicas de preparación de muestras. A partir del siglo XVII, estos avances técnicos repercutido en los campos de la biología celular y la medicina, y en ocasiones estos avances se produjeron recíprocamente.
Introducción
El desarrollo del microscopio está fuertemente acoplada con la evolución de la biología celular y la medicina. Microscopios proporcionan al observador con resolución mejorada (capacidad de observar dos objetos cercanos como objetos independientes), contraste (capacidad de detectar las diferentes regiones de la muestra sobre la base de la intensidad o color) y amplificación (capacidad de hacer que los objetos pequeños visible). El ojo humano puede resolver objetos del orden de 0,1 mm, mientras que el microscopio de luz puede resolver objetos del orden de 0,2 mm (200 nm) con una ampliación de 1000_.
El microscopio de luz
El microscopio simple contiene una única lente. El microscopio de luz compuesto se compone de varias lentes: la lente condensador (centra la iluminación), objetivo de microscopio (recolecta y enfoca la luz de la muestra) y una lente ocular o el ocular (forma una imagen en la retina). Si el aumento del objetivo se 100_and que del ocular es 10_, entonces el aumento total del microscopio compuesto es 1000_. El factor más importante es la resolución, que es una función de la NA (apertura numérica es una medida del cono de luz recogida igual a nsiny, donde y es el ángulo medio del cono de luz de la lente) de la lente objetivo, l o la longitud de onda de la luz de iluminación, y n es el índice de refracción del medio entre la muestra y el objetivo.
Fuentes de la invención y la innovación técnica en microscopía
La historia de themicroscope y sus técnicas asociadas está repleta de ejemplos de invención y desarrollo independientes que se extiende por muchos países y un período de unos pocos cientos de años. ¿Cuáles han sido las fuerzas impulsoras de la innovación técnica en microscopía? Es de notar que van Leeuwenhoek (el inventor del microscopio de lente única) fue un comerciante de telas, él creó sus primeros microscopios de lentes único que se puede observar los finos hilos de tela, y sólo a la edad de 40 años cuando dirigió su microscopio para organismos vivos hizo él sus descubrimientos monumentales.
Típicamente innovaciones técnicas en los instrumentos y técnicas dio lugar a nuevos descubrimientos en las ciencias de la vida, sin embargo, hay excepciones notables, como la invención del microscopio confocal, tal como una solución para el problema de cortar muestras ópticamente.
El desarrollo de varios tipos de microscopios ópticos incorporados los siguientes componentes: objetivos de microscopio que minimizan las aberraciones ópticas cromáticas y de otro tipo (distorsión de la imagen), se destaca que minimizar las vibraciones mecánicas y las fuentes de iluminación de la luz solar hasta láseres.
Además, hubo nuevos métodos de fijación y cortar las muestras (micrótomos), técnicas de tinción de muestras (colorantes, tintes, sondas moleculares) que muestra aumento de contraste.
Los primeros microscopios y su uso
La invención del microscopio se acredita a Zacarías Janssen (1587-1638) y su hijo Hans Janssen (1534 - 1592), dos fabricantes holandeses de anteojos que colocaron múltiples lentes en un tubo y se observa que la imagen fue ampliada. Antoni van Leeuwenhoek (1632-1723) utilizó su microscopio de lente única de observar solo las células bacterianas y otros microorganismos que él llamó "animálculos wee '. Estudió muchos especímenes incluidos los tejidos del hígado, cerebro, músculo y grasa (teñidas con un colorante). Adicionalmente, se observó la córnea del ojo, la lente, la retina, el nervio óptico, así como fluidos biológicos tales como sangre, orina, sudor y lágrimas. van Leeuwenhoek observó el flujo de los glóbulos de la sangre (glóbulos rojos) en los capilares de las branquias del renacuajo, señaló que el flujo fue simultáneo con el latido del corazón
el renacuajo. Él no era consciente de descubrimiento de Malpighi de los capilares sanguíneos (1660) y glóbulos rojos de la sangre (1674).
En 1664 Robert Hooke (1635-1703), contemporáneo de Newton, publicó Micrographia, un libro que atrajo una gran atención al microscopio y sus capacidades maravillosas. Hooke escribió en el prefacio de Micrographia que su motivación para el libro era promover el uso de instrumentos de la ciencia.
Más tarde, en 1665, Hooke observado células similares a las células (monje) en rebanadas de corcho y de hecho observaciones similares de las células vegetales.
Un avance importante en el diseño de los objetivos del microscopio se produjo cuando Joseph Jackson Lister (1786-1869) desarrolló su versión del objetivo acromático sin aberración esférica.
Giaovanni Battista Amici (1786-1863) fue otro innovador y desarrollador de microscopios. Él fue el primero en utilizar un objetivo de inmersión para aumentar la resolución (anterior sugiere Brewster). Se utilizó un objetivo de espejo elipsoidal para resolver el problema de las aberraciones cromáticas.
Esta idea fue propuesta por primera vez por Christiaan Huygens como un método para evitar las aberraciones cromáticas, a principios de Newton hizo una propuesta similar.
Durante un periodo de décadas el microscopio compuesto comenzó a lograr la mirada del microscopio óptico moderno.
Christian Hertel (1683-1725) en 1712 desarrolló la mecánica x-y escenario para mover la muestra con el control mecánico fino. En 1854, Camille SebastienNachet (1799-1881) inventó su versión del microscopio estereoscópico que contenía dos oculares. En 1897, la empresa fabricó su estereomicroscopio Zeiss que proporcionan vistas tridimensionales de la muestra.
Los avances en el diseño del microscopio
El mérito de los primeros avances teóricos en el diseño de microscopio basado en la física se da a Ernst Abbe (1840 - 1906). En 1866, el abate se reunió Carl Zeiss, quien propuso que abate establecer una base científica para la fabricación de microscopios ópticos. Abbe hecho contribuciones teóricas a las teorías del poder de resolución del microscopio, el papel de la difracción en la formación de la imagen, y la formación de aberraciones. En 1872, el abate formulado el abate
Condición Sine 'que permite el diseño de objetivos con la máxima resolución y aberraciones mínimas. Él inventó el condensador Abbe en 1872 que iluminó la abertura total del objetivo del microscopio y por lo tanto proporcionan la máxima resolución. En 1873, Abbe formulado el límite de resolución óptica de un microscopio en términos de la apertura numérica y la longitud de onda de la luz incidente.
El microscopio de fluorescencia
El siguiente problema a resolver era cómo lograr mayor especificidad y el contraste en microscopía óptica, y la solución fue la aplicación de la fluorescencia (luz incidente de longitud de onda corta causado una molécula fluorescente que emite luz de una longitud de onda más larga) a la microscopía. El colorante de fluoresceína que fue sintetizado por primera vez en 1871 tiene una larga historia conectado con la tinción de células. En 1881, el bacteriólogo Paul Ehrlich (1854-1915) utiliza fluoresceína para observar el paso de humor acuoso en el ojo. También usó varios colorantes fluorescentes anilina para teñir las bacterias y por lo tanto aumentar su contraste en el microscopio.
Agosto Ko ¨ hler (1866-1948) trabajando en la fábrica Zeiss Jena desarrolló en 1893 un nuevo sistema de iluminación microscopio (más tarde llamado Ko ¨ hler iluminación) con fines fotomicrográficos. También hizo observaciones al microscopio de autofluorescencia (auto-fluorescencia) de especímenes biológicos excitados con luz ultravioleta. Se observó la imagen ultravioleta de la cromatina sin teñir en el núcleo de la célula con luz incidente de 275 nm.
En 1903, Henry Wilhelm Friedrich Siedentopf (1872 - 1940) y Richard Adolf Zsigmondy (1865-1929) inventó el microscopio para observar ultra-coloides. Henry Friedrich Wilhelm Siedentopf construyó un condensador de campo oscuro que bloquea la luz incidente de entrar en el objetivo del microscopio, lo que mejora el contraste de la espécimen.
Henry Wilhelm Friedrich Siedentopf informó por primera vez que el uso de la luz ultravioleta produce la fluorescencia de muestras, y eso era un problema, ya que reduce el contraste de la muestra Sitio!
Luego, en 1904, agosto Ko ¨ hler inventó el microscopio de luz ultravioleta que precedió al microscopio de fluorescencia. Una cámara se requiere para detectar la imagen muy débil.
En 1910, Lehmann de la fábrica Carl Zeiss en Jena utiliza la fuente de luz desarrollado por el norteamericano Robert Wood (1868-1955) para hacer un prototipo de microscopio de fluorescencia.
En 1913, la empresa presentó su microscopio Zeiss luminiscencia. Posteriormente Max Haitinger (1868-1946) introdujo el "fluorochroming el término o la tinción fluorescente de los especímenes, y desarrolló muchas de las técnicas de tinción para la observación de ejemplares de la fluorescencia
microscopio. Al mismo tiempo, Carl Reichert de Viena desarrollado un microscopio de fluorescencia competir con un nuevo campo oscuro condensador cuarzo
Philipp Ellinger en la década de 1920 fue clave en el desarrollo del microscopio de fluorescencia intravital. Ellinger collorborated con August Hirt en su desarrollo. En
1933, Ellinger que era judío tuvo que dejar su cargo y posteriormente Hirt que fue miembro de las SS nazis alegaron que sólo él era el inventor del microscopio de fluorescencia intravital.
En 1929, la empresa Carl Zeiss en Jena produjo un microscopio intravital con iluminación vertical, un objetivo waterimmersion microscopio y una fuente de luz ultravioleta para las investigaciones de la distribución de los tintes fluorescentes en los riñones y el hígado de las ranas y los ratones. Este microscopio se utilizó posteriormente para las observaciones intravital de piel viva, el hígado y los riñones, y para estudiar la microcirculación de los órganos y glándulas del animal vivo.
El microscopio de fluorescencia
El siguiente problema a resolver era cómo lograr mayor especificidad y el contraste en microscopía óptica, y la solución fue la aplicación de la fluorescencia (luz incidente de longitud de onda corta causado una molécula fluorescente que emite luz de una longitud de onda más larga) a la microscopía. El desarrollo del microscopio de fluorescencia después de una serie de avances técnicos en el diseño del microscopio, así como el uso de moléculas intrínsecas de fluorescencia, así como moléculas sintéticas de fluorescencia. En la primera categoría son las nuevas fuentes de luz ultravioleta, el uso de filtros de líquidos para separar
longitudes de onda específicas o colores de iluminación, el uso de filtros de sólidos o líquidos para separar la luz de excitación incidente de la luz emitida que se produjo a longitudes de onda mayores, el diseño de los objetivos y lentes que pueden transmitir la luz ultravioleta y detectores fotográficos y de estado sólido a grabar las imágenes.
El colorante de fluoresceína que fue sintetizado por primera vez en 1871 tiene una larga historia conectado con la tinción de células. En 1881, el bacteriólogo Paul Ehrlich (1854-1915) utiliza fluoresceína para observar el paso de humor acuoso en el ojo. También usó varios colorantes fluorescentes anilina para teñir las bacterias y por lo tanto aumentar su contraste en el microscopio.
Agosto Ko ¨ hler (1866-1948) trabajando en la fábrica Zeiss Jena desarrolló en 1893 un nuevo sistema de iluminación microscopio Observó la imagen ultravioleta de la cromatina sin mancha en el núcleo celular
con la luz incidente de 275 nm.
En 1903, Henry Wilhelm Friedrich Siedentopf (1872 - 1940) y Richard Adolf Zsigmondy (1865-1929) inventó el microscopio para observar ultra-coloides.
Luego, en 1904, agosto Ko ¨ hler inventó el microscopio de luz ultravioleta que precedió al microscopio de fluorescencia. Una cámara se requiere para detectar la imagen muy débil. Ko ¨ hler utilizado el objetivo de cuarzo ultravioleta monocromática desarrollado previamente por Moritz von Rohr.
Philipp Ellinger en la década de 1920 fue clave en el desarrollo del microscopio de fluorescencia intravital. Ellinger collorborated con August Hirt en su desarrollo. En 1933, Ellinger que era judío tuvo que dejar su cargo y posteriormente Hirt que fue miembro de las SS nazis alegaron que sólo él era el inventor del microscopio de fluorescencia intravital.
En 1929, la empresa Carl Zeiss en Jena produjo un microscopio intravital con iluminación vertical, un objetivo waterimmersion microscopio y una fuente de luz ultravioleta para las investigaciones de la distribución de los tintes fluorescentes en los riñones y el hígado de las ranas y los ratones. Este microscopio se utilizó posteriormente para las observaciones intravital de piel viva, el hígado y los riñones, y para estudiar la microcirculación de los órganos y glándulas del animal vivo.
Albert Coons (1912-1978) y Melvin Kaplan son los inventores de inmunofluorescencia (1950) en el que está químicamente un colorante fluorescente unido a un anticuerpo; esta técnica dio lugar a un enorme aumento de la especificidad (debido a la especificidad del antígeno-anticuerpo) y dio como resultado en muchos avances en la biología celular.
Por ejemplo, en 1982 María Osborne y Klaus Weber utiliza el microscopio de fluorescencia junto con
anticuerpos monoclonales fluorescentes para visualizar la proteína tubulina citoesqueleto en las células.
La relación simbiótica entre Enduring el microscopio y Biología Celular
Durante la segunda mitad de los seres humanos del siglo XVII, por primera vez observar el mundo microscópico: organismos unicelulares, células vegetales, espermatozoides, la estructura fina de las alas de los insectos y los ojos compuestos, y los capilares del sistema vascular. Observaciones microscópicas tales como la observación de los espermatozoides Leeuwenhoek estimulado nuevas teorías de la generación, del mismo modo la observación de los capilares en el organismo provoca nuevas direcciones en el concepto de acción glandular. El microscopio demostró no sólo ser una herramienta útil para facilitar la observación de los microorganismos, pero se convirtió en una herramienta fundamental en la determinación de cómo los biólogos conceptualizado células y la vida misma.
Marcello Malpighi (1628-1694) estableció el campo de la anatomía microscópica en Bolonia donde descubrió capilares sanguíneos, observaron el cerebro, la lengua y la retina, y el desarrollo del embrión de pollo. Estudió los pulmones, los ganglios linfáticos y las glándulas y el cerebro.
El padre de la patología celular es Rudolf Virchow (1821-1902) quien abogó por el uso del microscopio en la patología. Virchow, en 1858, escribió "todas las células provienen de células". En esta declaración Virchow refutó las afirmaciones incorrectas en la formación de células de Schwann y realizados por Schleiden.
Su libro seminal Patología Celular demostrado que las enfermedades son consecuencia de una alteración de los procesos celulares normales.
El químico francés Louis Pasteur (1882-1895) realizó experimentos que dieron como resultado el derrocamiento de la teoría de la generación espontánea. De 1880 a 1890 se desarrolló vacunas para el ántrax enfermedades, el cólera y la rabia, y ayudó a apoyar la teoría microbiana de las enfermedades que se están desarrollando por su contemporáneo Robert Koch. Louis Pasteur demostró que los microorganismos son responsables de la purificación de la materia orgánica.
Robert Koch (1843-1919) es el fundador de una escuela seminal de la bacteriología, y sus estudiantes estaban entre los líderes importantes de la bacteriología europeo y americano.
En 1881, Koch desarrollado técnicas experimentales, microscopía es decir, tinción de los tejidos, el crecimiento de las bacterias en medios de cultivo sólidos, el aislamiento y cultivo puro de inoculación animal para entender el papel de Mycobacterium tuberculosis en la transmisión y progresión de la tuberculosis. Koch se acredita con los métodos para el estudio de las bacterias en cultivo puro. Koch conceptualiza la teoría microbiana de la enfermedad y las pruebas presentadas en su apoyo experimental.
Fue galardonado con el Premio Nobel 1905 de Fisiología y Medicina. Koch fue un innovador en microscopía: fue el primero en utilizar un objetivo de inmersión en aceite y el condensador Abbe (con un sistema de lentes para llenar la abertura total del objetivo del microscopio y así lograr una resolución máxima), el primero en publicar fotomicrografías de bacterias, e ideó métodos de tinción para bacterias para aumentar su contraste en el microscopio.
El proceso de la meiosis en los ovocitos de los Ascaris, un gusano nematodo. Boveri utiliza el microscopio para observar cómo los cromosomas redistribuir sus piezas en la división celular, los cromosomas se reduce a la mitad en células germinales (espermatozoides y óvulos) formación y, finalmente, sus cromosomas emparejados en el proceso de fertilización.
Independientemente de ello, entre 1902 y 1903 Walter Sutton quien trabajó en los Estados Unidos encontró resultados similares, demostró que los cromosomas contienen el material hereditario de células - los genes.
No sólo los avances en el diseño microscopio impacto en la biología celular, pero también hubo importantes avances en la preparación de muestras, el tejido de corte y técnicas de tinción.
Desde alrededor de 1820 microscopistas utilizados portaobjetos de vidrio para sus muestras. En 1875 Paul Mayer desarrollado el microtomo, un instrumento que puede cortar secciones muy finas de un espécimen. Por 1880 muestras se prepararon como sigue: fijación, deshidratación, la tinción con colorantes de anilina, inclusión en parafina, y se seccionó para producir secciones finas con un microtomo.
Nuevos avances en microscopía de luz: imágenes de células vivas
Marvin Minsky inventó el microscopio confocal (con la capacidad de especímenes sección ópticamente) en 1957. El desarrollo de varios tipos de microscopios confocales (un microscopio óptico lineal en el que la intensidad de la imagen es proporcional a la intensidad de la luz incidente) durante las últimas décadas proporcionan excelente capacidad de seccionamiento óptico a la estructura celular observada y la función. Su desarrollo fue motivado por la necesidad de biólogos celulares para muestras gruesas imagen sin la necesidad de mecánica (destructivo) seccionamiento.
Los biólogos modernos utilizar nuevos tipos de microscopios no lineales (el brillo de la imagen es una función del cuadrado de la intensidad de la luz incidente) que no estaban disponibles hace 15 años. Todos estos nuevos tipos de microscopios de proporcionar capacidad de seccionamiento óptico y son compatibles con imágenes en vivo a largo plazo de células, tejidos y organismos. Algunos de estos nuevos microscopios ópticos no lineales, como el microscopio de excitación multifotónica (la teoría de que fue publicado en la tesis doctoral de 1931 Maria Go ¨ ppert-Mayer) utilizan luz infrarroja de un láser pulsado para excitar la fluorescencia celular, ya sea de origen natural componentes o de producción genéticamente inducida de las proteínas fluorescentes.
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